摘要：菌種是主要的生物資源，一個優良的菌種被選育出來以后，必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產性能，能長期在生產中使用。MVE液氮罐

本文介紹了常用的微生物菌種的保藏方法:斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、冷凍真空干燥保藏法、液氮超低溫保藏法和基因工程菌的保藏，并比較了它們的優缺點。

關鍵詞：微生物;菌種;保藏

菌種是一個國家的重要自然資源，菌種保藏工作是一項重要的微生物學基礎工作，菌種保藏工作者的任務是把從自然界分離得到的野生型或經人工選育得到的用于科學研究和工業生產等方面的優良菌種、菌株，用各種適宜的方法妥善保存，使之達到不死、不衰、不變異、不污染，在長時間內保持原有的生產性狀和生命活力，以便于科學研究和生產使用。

1、保藏菌種用培養基

為了有效地保藏微生物菌種，首先需要有良好的培養基。因此，研究選用適宜的培養基是微生物菌種保藏最基本的工作。例如，ATCC(美國的一個微生物菌種保藏機構)在1970年以前采用的培養基有498種，1974年有724種，1978年達到1006種，平均每年增加60多種。

2、微生物菌種保藏的基本原理

人們在長時間的工作實踐中，根據微生物的不同要求，在菌種保藏工作中不斷摸索出各種方法。無論何種保藏方法，主要是根據微生物生理、生化特點,人工創造條件,使微生物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態。這些人工造成的環境主要是低溫、干燥、缺氧三者,此種條件,可使菌株很少發生突變以達到保持純種的目的。

3、微生物菌種的保藏方法

3.1　斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至4～6℃的冰箱中保藏。

保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2～4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照，防止因意外和污染造成損失。

此法的培養時間和培養溫度影響其保藏質量。培養時間過短，保存時容易死亡，培養時間長，生產性能衰退。成熟進行保藏，效果較好。

優點是操作簡單，能隨時檢。缺點是容易變異，因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀;污染雜菌的機會亦較多。

3.2　液體石蠟保藏法

亦稱礦物油保藏法，定期移植保藏法的輔助方法。

(1)液體石蠟的準備:選用優質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌:①121℃濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發水分，經無菌檢查后備用。②160℃干熱滅菌2h，冷卻后，經無菌檢查后備用。

(2)斜面培養物的制備:將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的菌體或孢子。

(3)灌注石蠟:用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。

(4)保藏:將試管直立，置低溫(4～6℃)干燥處或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1～2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優點是制作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養物移種后，接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。

3.3　濾紙保藏法

(1)將濾紙剪成0.5cm×1.2cm的小條，裝入0.6cm×8cm的安瓿管中，每管1～2張，塞以棉塞，121℃滅菌30min。

(2)養1～2mL滴加在滅菌培養皿，取數環菌苔在牛乳內混勻，制成濃懸液。

(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

(5)將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。

(6)將棉花塞入管內，用火焰熔封管口，保存于低溫下。

(7)需要使用菌種，復活培養時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養基內，置溫箱中培養。

細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14～17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設備。

3.4　沙土保藏法

(1)取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30min，以去除其中的有機質。

(2)倒去酸水，用自來水沖洗至中性。

(3)烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。

(4)另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅的時間還要長)。保藏時間2～10年。保藏期間應定期檢查，如培養基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟。

(5)恢復培養:恢復培養時，挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養基上，生長繁殖后，再重新轉接一次。

此法實用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。

(5)烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻，裝入10mm×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，121℃濕熱滅菌30min，烘干。

(7)進行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養基中，37℃培養48h，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。

(8)選擇培養成熟的(一般指孢子層生長豐滿的，營養細胞用此法效果不好)優良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。

(9)每支沙土管中加入約0.5mL(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液，以接種針拌勻。

(10)放入真空干燥器內，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務使在12h內抽干。

(11)每10支抽取一支，用接種環取出少數沙粒，接種于斜面培養基上，進行培養，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現雜菌或菌落數很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查。

(12)若經檢查沒有問題，，箱或室內干燥處保存。情況。

(13)需要使用菌種，，取沙土少許移入液體培養基內，置溫箱中培養。

此法多用于能產生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業生產中應用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應用于營養細胞效果不佳。

3.5　冷凍真空干燥保藏法

(1)安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15～20min，備用。

(2)準備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養基中用最適溫度培養，使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24～48h的培養物;酵母需培養3d;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養7～10d。

(3)制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，和脫脂牛乳2mL左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2mL。

(4)冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2)酒精液或干冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4～5min，即可使懸液結冰。

(5)將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8～20h。

(6)將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

(7)保藏:安瓿管應低溫避光保藏。

(8)質量檢查:冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。

(9):酒精棉花擦拭安瓿上部，在頂部，用挫刀或鑷子頸部輕叩一，，用無菌水或培養液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養基上，進行適溫培養。

此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽孢菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數年至十余年，但設備和操作都比較復雜。

3.6　液氮冷凍保藏法

(1)用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈，121℃下高壓滅菌15～20min，備用。

(2)保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10%～20%甘油。

(3)微生物不同的生理狀態對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養物。

菌種的準備可采用下列幾種方法:①刮取培養物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內。②接種液體培養基，振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內。③將培養物在平皿培養，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5～10mm)，真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內;在小安瓿管中裝1.2～2mL的瓊脂培養基，接種菌種，培養2～10d后，加入保護劑，待保藏。

(4)預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。

(5)保藏:將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。

(6)復蘇方法:從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38～40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50～10s。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。

3.7　基因工程菌的保藏

3.7.1　穿刺保藏法

使用容量為2～3mL并帶有螺口旋蓋和橡皮墊圈的玻璃小瓶，加入相當于約2/3脂，旋上蓋子，但并不擰緊，min。，冷卻至室溫后擰緊蓋子。

保藏細菌時，用一滅菌的接種針挑取良好的單菌落，把針穿過瓊脂直達瓶底數次，蓋上瓶蓋并擰緊，在瓶身和瓶蓋上均做好標記，室溫下存放于暗處。(更加廣為接受的做法是將瓶蓋放松，在適當溫度下培養過夜，然后擰緊瓶蓋并加封膜，最好于4℃或于室溫避光保藏。

穿刺法可保藏細菌2年之久。

3.7.2　甘油管冷凍保藏

(1)在液體培養基中生長的細菌培養物的保藏取細菌培養物，加入滅菌甘油(甘油應在1.034×105Pa高壓下蒸汽滅菌20min)振蕩培養物使甘油分布均勻，然后轉移至標記好的、帶有螺口和空氣密封圈的保存管內，在乙醇-干冰或液氮中凍結后轉至-70℃長期保存。復蘇菌種時，用滅菌的接種針刮拭凍結的培養物表面，然后立即把粘附在接種針上的細菌劃于含適當抗生素的LB瓊脂平板表面，凍干保存的菌種管重置于-70℃，而瓊脂平板于37℃培養過夜。

(2)在瓊脂平板上生長的細菌培養物的保存

從瓊脂平板表面刮下細菌放入裝有2mLLB的無菌試管內，再加入等量的含有30%滅菌甘油的LB培養基，振蕩混合物使甘油完全分布均勻后，分裝于帶有螺口蓋和空氣密封圈的無菌試管中，按上述方法冰凍保存。

甘油管冷凍保藏法可保藏10年以上，若實驗室不具備-70℃冰箱，也可把菌種放入-20℃冰箱中保藏，可保藏1年左右。

4、 總結

最好是每株菌種都采用兩種以上的保藏方法，并根據保藏菌種的保質期，每隔一定時間，進行入藏菌種的復活檢驗和更新。MVE液氮罐